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線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說明書
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
復(fù)合體Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體內(nèi)膜中大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對電子從NADH 傳遞給CoQ,同時可使O2還原生成O2.-,是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-的主要部位。測定該酶活性,不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態(tài),而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態(tài)。
測定原理
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成 NAD+,在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑四:液體 25mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑五:液體 1mL×1 支,-20℃保存;
試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存,用時加入2mL蒸餾水,現(xiàn)配現(xiàn)用。工作液的配制:臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解;現(xiàn)配現(xiàn)用;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g,4℃離心 5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ(此步可選做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20% 或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測定。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
(1) 工作液于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min。
(2) 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六,混勻,記
錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min 后的吸光值A(chǔ)2,計算ΔA=A1-A2。
復(fù)合體Ⅰ活力單位的計算
(1) 按蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T
=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)
÷T=365×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷
T=0.73×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm;d: 比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T: 反應(yīng)時間,2 min;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
(1) 按蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T
=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)
÷T=730×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)
÷T=1.46×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 L;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d: 96孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL; T:反應(yīng)時間,2 min;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。