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己烯雌酚快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物己烯雌酚的含量。

二、試劑盒特性

u試劑盒靈敏度：  0.1ppb

u 孵育溫度： 37℃

u 孵育時間： 30min～30min～15min

u 樣本檢測下限

組織（蝦、魚） ······························· 0.2 ppb

豬肉/肝 雞肉/肝 ······························· 2 ppb

肌肉組織(方法二)  ··························· 0.1 ppb

飼 料 ············································ 20ppb

尿 液 ··········································· 0.6ppb

u  交叉反應率

己烯雌酚 ········································ 100%

雙烯雌酚 ········································ 38.5%

己烷雌酚 ········································ 8.5%

己炔雌二醇 ··································· ﹤0.1%

雌三醇 ········································· ﹤0.1%

u樣本回收率

飼 料 ·········································· 90±10%

組 織 ·········································· 85±10%

尿 液 ·········································· 70±10%

三、試劑盒組成  

1  微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條

 標準液×6 瓶 0ppb 0.1ppb

2  0.3ppb 0.9ppb

 （1ml/瓶）  

  2.7ppb 8.1ppb

3 酶標記物 12ml 紅色帽

4 抗體工作液 7ml 藍色帽

5 底物 A 液 7ml 白色帽

6 底物 B 液 7ml 黑色帽

7 終止液 7ml 黃色帽

8 20X 濃縮洗滌液 40ml 白色帽

9 5X 濃縮復溶液 50ml 透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、

多道 30～300 µl

試 劑：乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷

酸（含量 85%）、乙酸乙酯

五、樣本前處理步驟

u樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本前處理需配制：

配液 1 6M H3PO4  溶液

100ml 濃 H3PO4（含量 85%）加去離子

水 150ml 混合均勻。

配液 2 2M NaOH 溶液

8gNaOH 加去離子水 100ml 溶解。

配液 3 1M NaOH 溶液

4gNaOH 加去離子水 100ml 溶解。

配液 4 乙腈-丙酮混合液

V 乙腈-V 丙酮 = 4 : 1

配液 5 樣本復溶液：

將5X 濃縮復溶液用去離子水 1：4 稀釋。

u樣本處理：

（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法

1、稱取 2±0.05g 勻漿后的樣本，加入 6ml 乙腈-丙

酮混合液，震蕩 2min，15℃，4000r/min 以上，離心 10min。

2、取 3ml 上清液，60℃氮氣/空氣吹干。

3、加入 0.5ml 氯仿，渦動 20s，加入 2ml 2M NaOH，

渦動 30s，4000r/min 以上，離心 5min。

4、取 1ml 上清液，加入 200µl 6M H3PO4，渦動 5s。5、加入 3ml 乙腈萃取，振蕩 2min，室溫 4000r/min

以上，離心 10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。

6、用 1ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混勻

30s。

不同樣本按如下方法稀釋：

1、 蝦魚：直接取 50µl 水相用于檢測。

2、 豬肉/肝、雞肉/肝：取 50µl 水相加入 450µl 樣

本復溶液，渦動混合 30s；取 50µl 用于檢測。

樣本的稀釋倍數(shù)：蝦魚稀釋倍數(shù)：2

豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：20

（b）肌肉組織處理方法二

1、稱取 2±0.05g 勻漿后的樣本，加入 2ml 2M

NaOH 溶液，震蕩 2min；2、加入 8ml 乙酸乙酯，劇烈震蕩 5min ；

3、 15℃，4000r/min 以上，離心 10min；

4、取 4ml 上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干；

5、用 1ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混勻

30s。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（c）飼料處理方法

1、稱取 2±0.05g 搗粹后的飼料樣本，加入 8ml 乙

腈，振搖 2min，15℃ 4000r/min 以上離心 10min；2、取 2ml 上清液，60℃氮氣/空氣吹干；

3、加入 0.5ml 氯仿，渦動 20s，加入 2ml 1M NaOH，

渦動 30s，4000r/min 以上，離心 5min；4、取 1ml 上清液，加入 100µl 6M H3PO4，渦動 5s；

不同樣本按如下方法稀釋：

1、 配合料：取 50µl，加入 950µl 樣本復溶液，渦

動混勻 30s，取 50µl 用于檢測。

2、 濃縮料/預混料：取 25µl，加入 975µl 樣本復溶液，渦動混勻 30s，取 50µl 用于檢測。

樣本稀釋倍數(shù)：

配合料稀釋倍數(shù)：100

濃縮料、預混料稀釋倍數(shù)：200

（d） 尿樣樣本處理方法

1、取 2ml 尿液到離心管中，室溫 4000r/min 以上，

離心 10min，直至清亮；2、移取 1ml 清亮尿液至離心管中，加入 1ml 1M

NaOH 強烈振蕩 5min；3、加入 100µl 6M H3PO4，渦動 30 s；

4、再加入 8ml 氯仿進行萃取，振蕩 5min。15℃，

4000r/min 以上離心 10min；

5、去掉上層的水相，取下層有機相 4 ml，60℃氮

氣/空氣吹干；6、用 3ml 樣本復溶液干燥的殘留物，混合 30s 7、取 50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：6

六、酶標免疫分析程序:

u測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～

25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放

入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應 30min。

6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、每孔加入酶標記物 100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B

液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色 15min。

9、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415； 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。

則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分 2、保 質 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見

吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 包裝盒。

孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘 提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正

以 100%，即   常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

 B

百分吸光率（%）＝  ×100%

 B0

B

—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以己烯雌酚標

準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù) 即為樣本中己烯雌酚實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～

25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。

8、該試劑盒最佳反應溫度為 37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。

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