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豬輪狀病毒抗體(RV-Ab)ELISA檢測試劑盒使用說明書
更新時(shí)間:2024-04-19 點(diǎn)擊量:272

本試劑盒只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷

Porcine)輪狀病毒抗體(RV-Ab)

ELISA檢測試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被輪狀病毒的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測抗原,經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD 值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中輪狀病毒抗體(RV-Ab)的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測,請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀(450nm)

2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

3.  預(yù)處理后的樣本請(qǐng)按照操作步驟用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋以達(dá)到試劑盒的的最佳檢測效果。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標(biāo)板

12孔×8條

12孔×4條

陰性對(duì)照

0.5mL

0.5mL

陽性對(duì)照

0.5mL

0.5mL

檢測抗-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

按說明書進(jìn)行稀釋

樣本稀釋液

6mL

3mL

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個(gè)

1個(gè)

 

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置陰、陽性對(duì)照孔和樣本孔,陰、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各50μL;

3.  待測樣本孔加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;

4.  隨后陰、陽性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 1.  試驗(yàn)有效性:陽性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00;

                陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。

2.  臨界值(Cut off)計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

3.  陰性判斷:樣品OD值<臨界值(Cut off),樣品為陰性

4.  陽性判斷:樣品OD值>臨界值(Cut off),樣品為陽性

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性:陽性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00;陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15,說明試驗(yàn)結(jié)果有效。

2.  特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

3.  重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

4.  貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

5.  有效期:6個(gè)月

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