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酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）標(biāo)準(zhǔn)化中存在的問(wèn)題

免疫測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的難點(diǎn)在于蛋白的不均一性、基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)以及需要測(cè)定接近測(cè)定方法下限的濃度等，所測(cè)定的免疫反應(yīng)性通常是在糖基化、降解和復(fù)合形式上有差異的蛋白同種型的混合體。

（一）基質(zhì)效應(yīng)

免疫測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)通常定義為干擾抗原和抗體間反應(yīng)但與分析物本身無(wú)關(guān)的非特異

因素?；|(zhì)效應(yīng)與測(cè)定模式和抗體選擇有較大關(guān)系，因此，其對(duì)不同免疫測(cè)定的影響方式也有所不同。基質(zhì)效應(yīng)通常由蛋白、鹽、磷脂、補(bǔ)體、抗免疫球蛋白抗體（類風(fēng)濕因子和人抗鼠抗體）、藥物和可能污染樣本的物質(zhì)引起。這些效應(yīng)可通過(guò)仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)減少，例如使用一定亞型的高親和力抗體或抗體片段、降低樣本對(duì)總測(cè)定體積的比例、在測(cè)定緩沖液中加入免疫球蛋白、理想的溫育溫度和較長(zhǎng)的溫育時(shí)間。免疫測(cè)定的校準(zhǔn)物通常用類似于樣本的基質(zhì)的緩沖液制備，基質(zhì)可為無(wú)分析物的人血清、無(wú)免疫學(xué)交叉反應(yīng)抗原的動(dòng)物血清或蛋白含量類似于樣本的人工緩沖液等。因?yàn)檠宓某煞指饔胁煌颗寤|(zhì)的差異有可能會(huì)影響校準(zhǔn)，因此以純蛋白溶液作為基質(zhì)較容易保持一致，但對(duì)于結(jié)合至血清蛋白的激索來(lái)說(shuō)，除了人血清外，其他基質(zhì)不能使用。

血清和血漿中總蛋白和鹽的濃度相當(dāng)穩(wěn)定，但尿液中鹽濃度則變化較大，鹽濃度增加對(duì)抗原抗體間反應(yīng)起一個(gè)抑制作用。如果樣本體積小于總反應(yīng)體積的10%~15%，則蛋白的影響不明顯，但有時(shí)為提高測(cè)定的敏感性，常需一個(gè)較大的樣本體積。因此，要求參考方法具有低的測(cè)定下限，且樣本體積對(duì)總反應(yīng)體積應(yīng)小至足以排除大部分基質(zhì)效應(yīng)。

樣本中的免疫球蛋白可通過(guò)與測(cè)定中所使用的特異抗體發(fā)生反應(yīng)而影響測(cè)定結(jié)果。如自身免疫病患者常有可與抗體反應(yīng)的類風(fēng)濕因子（RF）針對(duì)動(dòng)物免疫球蛋白的嗜異性天然抗體相當(dāng)普遍，但一般情況下其濃度和親和力較低。自身抗體和嗜異性天然抗體的存在通常會(huì)引起假陽(yáng)性反應(yīng)。這些干擾可通過(guò)加入足量的來(lái)自同一種系的免疫球蛋白而減小，也可在測(cè)定中使用抗體的Fab或（F‘ab）2片段替代完整抗體來(lái)減小干擾，但如果樣本含有針對(duì)試劑抗體的個(gè)體基因型（idiotype）抗體，則這種方法無(wú)效。這種情況下只有將免疫球蛋白從樣本中去除或使用一個(gè)依據(jù)另一個(gè)抗體的方法測(cè)定。

各種補(bǔ)體成分均能與抗體反應(yīng)，從而干擾試劑抗體結(jié)合抗原及與次級(jí)抗體反應(yīng)的能力，在雙夾心測(cè)定中可引起假陽(yáng)性，在競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)中引起假陽(yáng)性。小鼠IgG2,和IgG2,免疫球蛋白亞對(duì)補(bǔ)體的效應(yīng)尤為敏感?？赏ㄟ^(guò)加熱樣本或在反應(yīng)緩沖液中加入螯合劑來(lái)排除補(bǔ)體的干擾，但加熱會(huì)影響很多的分析物，而螯合劑對(duì)諸如鍺螯合劑和酶等非放射性核索標(biāo)記物有干擾，因此傾向于使用對(duì)補(bǔ)體效應(yīng)不敏感的抗體或抗體片段建立測(cè)定方法。

有報(bào)道稱磷脂在類固醇測(cè)定中可干擾抗原的結(jié)合而引起結(jié)果的假增高，許多其他因子如血清分離膠中的成分、抗凝劑去垢劑、藥物、非酯化脂肪酸等對(duì)某些免疫測(cè)定也有干擾。

（二）抗原的不均一性和交叉反應(yīng)性

蛋白激索顯然是不均一的，其在血液循環(huán)中除了有生物學(xué)活性形式外，還有前激索、片段和亞單位。富甲狀腺索（PTH）、ACTH及其前體、催乳索和促胃液索的大的形式以及生長(zhǎng)激索的拼接變異體等均可引起測(cè)定問(wèn)題。使用單克隆抗體的兩位點(diǎn)雙夾心測(cè)定大大改善測(cè)定的特異性，例如使用抗絨毛膜促性腺激索的。和P亞單位的單抗建立的雙夾心方法將不會(huì)測(cè)定游離的亞單位。使用針對(duì)ACTH或PTH的氨基和羧基末端部分的兩個(gè)抗體建立的雙夾心方法則不會(huì)測(cè)定無(wú)生物學(xué)活性的片段。一般情況下，所希望測(cè)定的是具有生物學(xué)活性的成分，但有時(shí)為了某些特定的臨床目的，則需要有特異的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定降解產(chǎn)物，如hCG的核心成分。因此，為保證測(cè)定的特異性，就不僅要求有具有生物學(xué)活性的激索標(biāo)準(zhǔn)晶，而且要有臨床上相關(guān)的降解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品。

某些血清蛋白有在等電點(diǎn)上不同（如。1―抗胰蛋白酶）或聚合程度不同（如觸珠蛋白）的各種遺傳變異體，盡管這些變異體的比例不同會(huì)影響其免疫測(cè)定的結(jié)果，但這并不是血清蛋白免疫測(cè)定的突出問(wèn)題。用于血漿蛋白測(cè)定的試驗(yàn)通常使用多克隆抗血清，多克隆抗體測(cè)定不了蛋白結(jié)構(gòu)上的微小差異。相反，使用單克隆抗體則有可能測(cè)不到某些變異體，這是血清蛋白免疫測(cè)定上的一個(gè)普遍問(wèn)題糖蛋白的不均一性主要在于糖基化尤其是唾液酸含量的差異，唾液酸含量上的差異進(jìn)而引起蛋白等電點(diǎn)和電泳移動(dòng)性的差異?？贵w通常對(duì)這些差異不敏感，因此，糖的不均一性對(duì)免疫反應(yīng)性影響很小。然而蛋白上的糖鏈可通過(guò)修飾或覆蓋一個(gè)肽決定基而改變蛋白的免疫反應(yīng)性。相反，黏蛋白的主要抗原決定基則由糖成分所組成。免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上小的差異也會(huì)引起多態(tài)性抗原測(cè)定結(jié)果上較大的差異，黏蛋白抗原CA125,CA19―9和CA15―3的測(cè)定可以很明確的證明這一點(diǎn)。例如，由不同組織產(chǎn)生的CA15―3含有不同數(shù)量的20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列，而試驗(yàn)中測(cè)定抗原所用的單抗是用腫瘤細(xì)胞制備的，因而所測(cè)定的抗原是結(jié)構(gòu)不太明確的大分子。盡管大多數(shù)試劑廠家均使用相同的標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，但其相互之間的相關(guān)性很差，這很可能是由于在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上的差異所致，因此每一種方法都應(yīng)有各自的參考范圍值。

（三）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

免疫測(cè)定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要涉及到抗體或抗原的使用濃度、溫育溫度、溫育時(shí)間、測(cè)定模式是采用競(jìng)爭(zhēng)抑制或雙夾心直接測(cè)定，以及雙夾心測(cè)定是采用一步還是兩步法等，其對(duì)測(cè)定的影響主要是試驗(yàn)的測(cè)定下限、特異性核簡(jiǎn)便性等。一般來(lái)說(shuō)，較高的抗體或抗原反應(yīng)濃度、較高的溫育溫度（如37~C而非室溫下）、較長(zhǎng)的溫育時(shí)間可以改善免疫試驗(yàn)的測(cè)定下限，但這一切又只是相對(duì)的，還要從試劑的實(shí)際應(yīng)用著想，進(jìn)行合理的優(yōu)化。雙抗夾心酶免疫試劑由于其簡(jiǎn)單方便，又具有較好的測(cè)定下限和特異性，在大多數(shù)蛋白激索和腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定上，現(xiàn)已基本上取代了放免競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)。雙抗夾心測(cè)定模式以兩步法進(jìn)行（即臨床樣本與酶標(biāo)抗體分兩步加入），可避免許多用一步法時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題，如與標(biāo)記抗體可能發(fā)生交叉反應(yīng)但與固相捕獲抗體無(wú)交叉反應(yīng)的物質(zhì)可在*步溫育后的洗滌步驟中去除；又如一步法常出現(xiàn)的“鉤狀”效應(yīng)（即抗原濃度很高時(shí)反應(yīng)顯色反而很淺，表現(xiàn)為測(cè)假陽(yáng)性）使用兩步法就可以避免。但由于兩步法所需測(cè)定時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一些，因此目前在臨床實(shí)驗(yàn)中使用較多的是一步法。此外，當(dāng)所測(cè)物質(zhì)分子大小不一致時(shí)，大分子的反應(yīng)通常較小分子要慢，如溫育時(shí)間短，也會(huì)造成測(cè)定偏差。例如，在測(cè)定復(fù)合的前列腺特異抗原（PSA）（Mr90Kd）時(shí)，如使用較短的溫育時(shí)間，與游離PSA相比，其結(jié)果將偏低。

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